[方法] WGCNA

回复:0 | 查看:125 | admin 发表于 2018-7-21 17:56:58 |阅读模式 |复制链接
相关网络(correlation network)共表达权重网络(co-expression weighted network)是一个无向有度(undirected, weighed network)的网络。一般分为两种网络:
unsigned网络中,相关度为
singed网络中,相关度为而对于一个“无度(unweighted network)”,基因与基因之间的相关度只能是0或者1,0表示两个基因没有联系,而1表示有。

构建共表达网络的基本思路是:首先根据表达谱数据直接计算每个基因之间“相关度(adjacency)”并且构建不同的module,之后根据特定的生物学参数筛选合适的module。


样本聚类:flashClust包提供了一种比hclust()较快的聚类方法,比如sampleTree = flashClust(dist(datExpr0), method = "average")。也可以直接使用plotClusterTreeSamples()直接查看样本聚类情况,如下图,y表示样本的一个分类,比如正常组和对照组。
注意:datExpr0中行代表样本,而列代表基因。



0. 数据前处理
WGCNA包对芯片数据有特殊的处理习惯,即将芯片数据矩阵的行表示为样本,列表示基因。所以N×M矩阵,表示N个样本,M个基因。正因如此,如果使用函数dist(exprData)可以得到按照样本(即“按行聚类”)的聚类结果。

1. 选择何时“软阀值(soft thresholding power)”beta
使用函数pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, networkType = 'unsigned', verbose = 5)。其中,dataExpr的行列要求与上相同;powerVector可以是一系列数值,从而选择最优值;networkType可以选择unsigned(无向?)或者signed(有向?);默认Rsquared阀值是0.85。

这个函数返回一个列表,第一项是powerEstimate是估计的最优power;第二项是fitIndices是详细的矩阵数据,其中第五列是mean.k表示平均“连接度(connectivity)”。连接度是指某个基因与该网络中其他基因的相关程度,常为“相关度”之和。

2. 构建网络
使用函数blockwiseModules()自动构建不同module。这个函数有大量的参数可供调试,比较重要的有:maxBlockSize默认为5000,表示在这个数值内的基因将整体被计算,如果调大需要更多的内存;power是软阀值;deepSplit是分割灵敏度,取值在0到4(最灵敏)之间,默认是2;minModuleSize设定每个modle的对小容量(即节点数),可以调大;numericLabels默认为FALSE返回颜色,设定为TRUE则返回数字;mergeCutHeight是在计算完所有modules后,将特征量高度相似的modules进行和并,和并的标准就是所有小与mergeCutHeight数值,默认为0.15,可以调大(即减少module);pamRespectsDendro逻辑值,默认为TRUE,可以设定为FALSE。

返回结果是一个列表,第一个colors表示基因被分为不同的module,0表示没有任何module接受,可以使用table()函数查看,如果返回的是数字,可以使用labels2colors()转换为对应颜色;MEs是一个关于modules的特征量矩阵,行数等于筛选的modules数,列数等于样本数;dendrograms表示在一个block中所有基因的进化树图

也可以分步构建网络。1. 计算每个基因之间的“相关度(adjacency)矩阵”,使用函数adjacency(),返回N×N的矩阵,N表示所有基因数。同时,可以计算每个基因的连接度(即colSums()),之后使用scaleFreePlot()查看连接度,并且判断网络是否属于“无标度拓扑网络(scale free topology)”。因为无标度网络的连接度有幂律分布,因此scaleFreePlot()会呈现线性。2. 计算TOM(Topological Overlap Matrix),使用函数TOM=TOMsimilarity()计算相似矩阵,使用TOMdist()计算不相似矩阵(即1-TOM)。3. 构建基因进化树,使用函数flashClust(),使用plot()函数查看进化树,hang参数调整分枝度,hang越小,树枝越少;进化树的每一个树枝代表一个基因。4.使用dynamicTreeCut包修剪树枝,使用函数cutreeDynamic(),参数与blockwiseModules()相似。也可以使用cutreeStaticColor()修剪树枝。两种方法各有利弊,可以根据生物学意义选择。 5. 和并相似的共表达网络,这个过程相对于把上一步筛选得到的modules再进行聚类,使用函数moduleEigengenes(),确定修剪高度后,使用mergeCloseModules()函数和并modules。

使用函数plotDendroAndColors()查看系统发生树;blockGenes是一个block中所有的基因。dendro表示进化树;而colors表示modules的颜色,如果需要表示不同的modules对比,只需要把colors进行和并cbind()即可。这将有利于展示不同的module划分方法,并且有助于选择modules。

3. 结合外部生物学参数选择模型
通常我们会得到多个module,这时需要结合其他生物学信息选择合适的模型。“基因显著参数(Gene Significance, GS)”为非负数字信息,比如基于样本的临床数据(clinical trails)和基于每个基因的
-log(p-value)等。
3.1 结合样本信息,比如样本的重量、长度、程度等信息
样本信息应该是一个非负矩阵,行数等于样本数。具体步骤:1. 计算模型特征矩阵和样本信息矩阵的相关度,使用函数cor(),方法可以选择Pearson。矩阵中的数值范围是(-1,1),越接近于-1表示负相关,越接近于1表示正相关,说接近于0表示相关性最弱。2. 计算相关度的p值,使用函数corPvalueStudent(cor, nSamples),p值的越小表示相关性越显著。之后,可以使用labeledHeatmap()将模型和上述相关矩阵可视化,比如下图。从下图可以看出与weight相关的modules中,棕色(相关性最强),其次是红色、肉色和蓝色。所以,如果以weight为指标,我们可以选择这四个modules作为下一步研究对象。
注意:
第一步,计算模型与样本信息相关矩阵时候,模型矩阵与样本信息矩阵的行应该相同。比如,模型矩阵是K×P(K个样本,P个模型),样本信息矩阵则为K×Q(K个样本,Q个样本信息)。最后得到一个P×Q的矩阵。


在选定module后,还可以看这个module的特征向量与样本信息内,在考虑到每个基因层面上的相关性。步骤如下:1. 计算全表达谱矩阵与特征向量矩阵相关性。2. 计算全基因表达谱与样本信息相关性。3. 使用verboseScatterplot()绘制相关性图,如下。




还可以将样本信息与module特征向量矩阵结合在一起(直接cbind()在一起即可),使用plotEigengeneNetworks()查看,如下图。也可以控制plotHeatmaps参数和plotDendrograms参数分别输出上下两个图。




查看module与每个基因GS之间的相关性,可以使用函数plotMEpairs(),或者psych包的pairs.panels()函数,以PerformanceAnalytics包的chart.Correlation()函数,如下图。


     


同时,可以绘制一个module的基因表达量与该module特征向量图,联合使用plotME()和barplot()函数。






3.2 结合每个基因信息,比如p值、q值等
同样,也可以结合每个基因信息筛选合适的module。比如,经过多重假设检验计算得到的p值(可以转换为-log(p-value))、矫正后的q值、在某条生物学通路中(GO分类、细胞位置、转录因子调控等)的基因(0表示存在,1表示即不存在)等等。使用plotModuleSignificance(GS, modulecolor)函数作出条形图,这个条形图的纵坐标的实质就是,基因在每个模型中对应GS的均值。下图表示了每个基因的p值经过处理后,对应module的GS均值。在这种情况下,我们可以优先考虑研究绿色的module。




与此同时,还可以使用得到网络根据GS筛选基因,networkScreening()筛选样本信息相关的基因,networkScreeningGS()筛选基因信息相关的基因。




3.3 研究每个module的生物学意义
在得到每个module后,相当于将基因做了分类(对于每个module,类似于找到的一部分基因)。那么,就可以使用类似的GO、生物学通路等等分析,进而解释每一个module的生物学意义。

4. 可视化网络
4.1 查看TOM图
TOM图是指基因和筛选模型的可视化表示。生成TOM图的步骤:1. 生成全基因不相似TOM矩阵,比如1-TOMsimilarityFromExpr(datExpr, power = 6),可以把得到的不相关矩阵加幂,这样绘制的TOM图色彩差异会比较明显。2. 使用TOMplot()绘制TOM图,如下图。图上和图左是全基因系统发育树,不同颜色亮带表示不同的module,每一个亮点表示每个基因与其他基因的相关性强弱(越亮表示相关性越强)。





绘制module的multi-dimensional scaling (MDS)图,首先使用函数cmdscale()分解TOM不相似矩阵,之后使用plot()函数绘制,如下图。





4.2 查看网络

查看生成的网络:可以使用VisANT:http://visant.bu.edu/查看筛选的网络。先生成网络拓扑结构,使用函数TOMsimilarityFromExpr();之后,筛选特定的module,形成一个M×M的矩阵,表示这个网络中有M个节点(node);最后,使用exportNetworkToVisANT()函数生成visant的输入类型文件,即choose(M,2)个“边(edge)”。也可以使用exportNetworkToCytoscape()函数,生成Cytoscapte类型的输入数据。


参考网址:
1. WGCNA官网:[url=]http://labs.genetics.ucla.edu/horvath/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/[/url]
2. 无标度网络:http://zh.wikipedia.org/wiki/无尺度网络
3. R数据相关性表示:http://pgfe.umassmed.edu/ou/archives/3143

转自:http://blog.sina.com.cn/s/blog_61f013b80101lcpr.html



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